hBMP7基因修饰的髓核细胞与同种异体椎间盘复合后体内原位...

前进的中医正骨

       目的：在同种异体椎间盘移植的基础上，探讨用基因修饰的犬髓核细胞与同种异体椎间盘复合的方法阻止或延缓同种异体椎间盘移植后出现的退变性问题的能力。    方法：将15个犬椎间盘置于冻存液中于-196℃冷冻保存2m，随机分为A、B、C三组，A组以rAAV2-hBMP7转染犬髓核细胞，将能够表达hBMP7蛋白的1×105髓核细胞于20ul DMEM/F12培养基中注射入复温后椎间盘中，体外培养至7天，B组以相同数量未转染髓核细胞注入椎间盘后体外培养，C组以20ul生理盐水注射后体外培养。将培养7天的A、B和C三组椎间盘分别移植至15只Beagle犬L4-5椎间盘，在术前、术后2w、1m、3m和6m通过DR检测移植椎间盘愈合情况及移植椎间盘高度随时间的变化情况；而在术后的1m、3m和6m通过检测移植间盘髓核组织的MRI T2像来分析椎间盘的退变情况；将动物饲养至术后6m时处死取材，对新鲜的腰椎进行生物力学检测，通过MTS分析腰椎屈伸、侧弯及扭转的变化；并通过HE及胶原染色观察移植椎间盘的形态学改变；对于A和B组椎间盘中注射的髓核细胞再注射前以PKH-26膜染料进行荧光标记，将取材后的部分椎间盘组织进行冰冻切片，通过PKH-26的红色荧光观测注射的外源性髓核细胞的存活情况；取材后通过PCR法检测三组髓核组织中hBMP7 mRNA的表达。
& e/ u3 e) _& [9 |2 h1 N    结果：DR片检测结果显示除C组有1例犬的移植椎间盘出现了跨椎间盘的骨性融合外，其余14例移植椎间盘均与上下椎体愈合，且未见明显的骨刺形成，对植入椎间盘的高度的动态监测显示三组椎间盘高度改变未见差别（p<0.05）；MRI检测结果显示：术后1m三组MRI T2像灰度比未见差别，而在3m和6m时，移植椎间盘MRI T2像信号灰度比显示A组>B组>C组（p<0.05）；生物力学检测结果示：当扭矩为3N.m时，A组扭转活动度为5.4±0.8°，B组6.7±0.7°，C组为13.1±1.3°，可见C组的活动度明显大于A组及B组（p<0.05），而A组及B组间无统计学差别（p>0.05），而对屈伸及侧弯活动度检测发现三组间未见统计学差别；PKH-26荧光检测显示在A和B组复合髓核细胞的同种异体椎间盘在移植后的6m时，仍可在荧光显微镜下观察到红色荧光的散在表达，证明移植后6m时仍有外源性髓核细胞存活；对三组椎间盘的HE形态学检测结果发现三组移植间盘结构均有退变性改变，而A组及B组退变性改变明显较C组轻；髓核的胶原染色显示A组髓核组织胶原含量较B组及C组明显增多，B组较C组胶原纤维轻度增多；PCR检测结果显示：6m时A组仍可检测到hBMP mRNA的高表达。
    结论：通过将hBMP7基因修饰的髓核细胞同同种异体椎间盘复合后在行异体移植的方法能明显延缓单纯的同种异体椎间盘移植后的退变性问题。但需要大规模的动物实验进行相关结果的进一步验证。